El avance de la ciencia ha sido posible, en gran parte, gracias al uso de innovadoras y recientes tecnologías que año a año perfeccionan las técnicas tradicionales. Dentro de ello, NextSeq 550 es un equipo de secuenciamiento masivo, lo que supone una lectura de la posición de cada nucleótido que conforma la secuencia de ADN o ARN en estudio. Su denominada tecnología Next Generation le permite la obtención de datos altamente reproducibles, de gran fiabilidad y exactitud. Nextseq 550 puede realizar estudios a nivel genómico, reportando nuevas variantes génicas relacionadas a mutaciones particulares. Actualmente, estos cambios en los genes del parasito malaria han sido asociados a su resistencia al conocido fármaco antimalarial, Artemisinin. De esta forma, Nextseq 550 puede también realizar estudios a nivel transcriptómica evaluando perfiles de expresión de todo el genoma completo, un claro ejemplo es el estudio realizado en el perfil transcriptómica de Mycobacterium tuberculosis, persistente, el cual asocia la expresión de ciertos genes con su estado de persistencia o dormancia. Por último, esta tecnología puede realizar estudios a nivel de exomas, lo cual permite la evaluación solo de genes codificantes a proteínas o de genes seleccionados; un estudio reciente usando tecnología de este tipo demostró una alta asociación entre autismo y mutaciones de novo de ciertos genes. De modo que esta tecnología podría ser usada como herramienta de diagnóstico de ciertos síndromes y patologías.

Una de las ventajas que facilita el acceso por parte de los investigadores a esta tecnología es el bajo costo que implica su servicio, así como la rapidez en la obtención de datos a partir de varias muestras analizadas en simultáneo. Como ventaja extra, cuenta con una característica particular que lo convierte en un equipo de uso completo, pues provee a partir de data cruda resultados en términos publicables. La suma de todas estas ventajas ha posicionado a este equipo como una tecnología disponible no solo a investigadores del área de biología, sino también a otras áreas involucradas, pues genera un desarrollo conjunto, complementario e integrativo a favor de la ciencia, tecnología y educación.

El avance de la ciencia ha impulsado no solo un trabajo conjunto y colaborativo de diversas áreas de investigación, sino también ha permitido conocer en detalle el funcionamiento, mecanismo, rol y repercusión de moléculas implicadas, así como su interacción con otras dentro de la célula. Cabe mencionar que la implementación y manejo de tecnologías como la de NextSeq550 favorecerán el desarrollo tecnológico y científico, a fin de posicionar a Perú como uno de los países con proyectos en ejecución de tecnología avanzada.

Objetivo General

Determinar el efecto de la pirazinamida a diferentes pHs relacionado a la expresión genética mediante RNA-seq (transcriptómica) en M. tuberculosis y M. bovis

Objetivo Específico 1

Adquisición del equipo y puesta en marcha

Objetivo Específico 2

Evaluar el efecto de pirazinamida a diferentes pH en la expresión genética de M. tuberculosis usando una cepa sensible y 3 cepas clínicas resistentes a pirazinamida sin mutaciones en pncA

Objetivo Específico 3

Evaluar la relación entre los genes candidatos seleccionados con expresión genética diferencial mediante represión (CRISPRi) y la resistencia a pirazinamida

Objetivo Específico 4

Evaluar a nivel transcriptómica el efecto de PZA en Mycobacterium bovis, resistente natural a PZA.

Descripción

El aún poco entendido mecanismo de resistencia a pirazinamida (PZA) en M. tuberculosis (MTB). Particularmente, aquellas cepas que no presentan mutaciones en genes como pncA, imposibilitan la detección temprano de la resistencia a PZA. El tratamiento inadecuado genera resistencia adquirida, un problema nacional y global.

El conocimiento a nivel transcripcional de cepas resistentes a PZA no explicadas por mutaciones en pncA es un ámbito no muy investigado.Por lo que el análisis transcriptómica nos permitiría estudiar la relación entre la expresión genética y la resistencia a PZA; posteriormente, nos permitiría estudiar a fondo la participación de los genes con expresión diferencial en rutas metabólicas en las que participa PZA y ácido pirazinoico (POA). Asimismo, los genes podrían ser candidatos de probables targets terapéuticos en el tratamiento contra TB, como base para futuros trabajos.

Hasta la fecha, los estudios del mecanismo de acción de PZA se han basado en análisis genómicos, relacionando mutaciones en genes específicos de cepas resistentes a PZA. Sin embrago, existe evidencia de que el cambio en la expresión de genes puede afectar la resistencia: nuestro grupo de trabajo ha encontrado una relación directa entre la mutación -11 en el promotor del gen pncA, que anula su expresión y resistencia a PZA.

Los genes seleccionados en el análisis del transcriptoma de MTB serán estudiados en forma individual mediante el silenciamiento genético (CRISPRi) para evaluar su efecto en la resistencia a PZA. Asimismo, se realizarán estudios complementarios del efecto de PZA en el transcriptoma de Mycobacterium bovis, resistente natural a PZA. Aún no existe ningún estudio que haya evaluado el efecto de la complementación de la enzima PZAsa en Mycobacterium bovis a nivel transcriptómica. Para entender este efecto, se transformará el gen pncA silvestre mediante un vector de expresión micobacteriano en Mycobacterium bovis y se expondrá a diferentes condiciones.

El análisis transcriptómica mediante ARN-seq es la mejor herramienta disponible en la actualidad. Consiste en la extracción de ARN total, retrotranscripción a ADNc y secuenciamiento de segunda generación (NGS). Las ventajas del análisis transcriptómica involucran lo siguiente: 1) permite determinar qué genes están siendo expresados sin necesidad de conocer la secuencia en distintas condiciones; 2) permite determinar genes no reportados anteriormente y que solo son expresados en determinada condición; y 3) calcula con mucha exactitud la abundancia de una secuencia, indicando el nivel de expresión de dicho gen. Para lograr esto es necesario tener el equipo de alto rendimiento (High-throughput) adecuado que proporcione datos de alta calidad, infraestructura computacional que pueda procesar información con algoritmos robustos y eficientes, basados en principios estadísticos sólidos y personal capacitado en bioinformática que lleve a cabo dichos análisis.

En este proyecto estamos solicitando un secuenciador de alto rendimiento NextSeq 550, capaz de secuenciar hasta 48 muestras en 20 horas. La calidad de los resultados está asegurada debido a que se obtiene hasta 40 millones de lecturas (reads) por muestra. Actualmente, la entidad colaboradora, Grupo de Bioinformática, cuenta con infraestructura computacional óptima (un sistema blade center IBM HS22 de 75 núcleos) y personal calificado con capacidad de procesar data de múltiples muestras y realizar análisis estadísticos que permitan llegar a conclusiones de alta confianza.

El secuenciador NextSeq 550 tiene capacidad de generar alto impacto regional y nacional debido a que puede procesar muestras de diferentes orígenes (animal, vegetal, virus, bacterias, etc.) y determinar la asociación genética y expresión genética con diversos determinantes. Un ejemplo es la investigación del doctor Neyra de la UPCH, quien desea usar el equipo en el «Análisis transcriptómica de Quenopodium quinoa resistentes a sequía».

Institución Responsable del Equipamiento

Universidad Peruana Cayetano Heredia

RUC: 20110768151

Tipo de entidad: Universidad

Régimen: Privado

Tipo de organización: Sin fines de lucro

Departamento: Lima

Provincia: Lima

Distrito: San Martin de Porres

Dependencias: Laboratorio de Bioinformática y Biología Molecular Grupo Biología Molecular y Laboratorio de Bioinformática y Biología Molecular Grupo Bioinformática

Entidad Colaboradora de interés de uso

Universidad Católica Santo Toribio de Mogrovejo

RUC: 20395492129

Tipo de entidad: Universidad

Régimen: Privado

Departamento: Lambayeque

Provincia: Chiclayo

Distrito: Chiclayo

Universidad Privada San Juan Bautista S.A.C.

RUC: 20344818909

Tipo de entidad: Universidad

Régimen: Privado

Departamento: Lima

Provincia: Lima

Distrito: Chorrillos

Universidad Peruana de Ciencias Aplicadas

RUC: 20211614545

Tipo de entidad: Universidad

Régimen: Privado

Departamento: Lima

Provincia: Lima

Distrito: Santiago De Surco

Universidad de Ingeniería y Tecnología

RUC: 20545990998

Tipo de entidad: Universidad

Régimen: Privado

Departamento: Lima

Provincia: Lima

Distrito: Lima

Pontificia Universidad Católica del Perú

RUC: 20155945860

Tipo de entidad: Universidad

Régimen: Privado

Departamento: Lima

Provincia: Lima

Distrito: San Miguel

Universidad Nacional Mayor de San Marcos

RUC: 20148092282

Tipo de entidad: Universidad

Régimen: Público

Departamento: Lima

Provincia: Lima

Distrito: Lima

Investigador Principal

Nombres: Patricia

Apellido paterno: Sheen

Apellido materno: Cortavarria

Entidad: Universidad Peruana Cayetano Heredia

Dependencia: Laboratorio de Bioinformática y Biología Molecular Grupo Biología Molecular

Coinvestigadores

Nombres: Mirko Juan

Apellido paterno: Zimic

Apellido materno: Peralta

Grado académico: Doctorado

Entidad: Universidad Peruana Cayetano Heredia

Dependencia: Laboratorio de Bioinformática y Biología Molecular Grupo Bioinformática

Nombres: Cesar Miguel

Apellido paterno: Gavidia

Apellido materno: Chucan

Grado académico: Doctorado

Nombres: Ricardo Alfonso

Apellido paterno: Antiparra

Apellido materno: Villa

Grado académico: Magister

Entidad: Universidad Peruana Cayetano Heredia

Dependencia: Laboratorio de Bioinformática y Biología Molecular Grupo Biología Molecular

Técnico

Nombres: Eduardo

Apellidos: Gushiken Ibañez

Entidad: Universidad Peruana Cayetano Heredia

Coordinador Administrativo

Nombres: Celinda Bertha

Apellidos: Solano Valdez

Entidad: Universidad Peruana Cayetano Heredia

Equipamiento Mayor

Un equipo mayor es un equipo altamente sofisticado de un valor superior a S/. 600,000.00 que, por la relevancia de su uso en la investigación científica, tiene la capacidad de generar impacto regional y/o nacional en relación con la disponibilidad de tecnología. Así, la adquisición de este equipo permitirá cubrir necesidades de acceso a tecnologías de investigación de alto costo que, por una parte, no se encuentran suficientemente desarrollados y/o por debajo de estándares nacionales y que, por otra parte, aún no se encuentran disponibles en la región o en el país.

Nombre del equipo mayor

Sistema de Secuenciamiento Masivo (NGS)

Descripción condiciones técnicas

El sistema NextSeq 550 combina la capacidad de secuenciamiento a gran escala con la simplicidad de un secuenciador compacto. Su flujo de trabajo rápido e integrado, desde el procesamiento de las muestras hasta el análisis, le permite el secuenciamiento rápido de exomas, genomas y transcriptomas en una sola corrida, con la flexibilidad de intercambiar a secuenciamiento a baja escala cuando es necesario. Además, cuenta con la opción para lectura de microarreglos para salud reproductiva y genética en humanos. Este sistema encaja perfectamente en los laboratorios de investigación y no requiere equipamiento especializado. Hay una distinta configuración de kits para las distintas aplicaciones y escalas requeridas por el usuario.

Esta máquina es capaz de procesar hasta 48 muestras de ARN (RNA-Seq) en 18 horas con alta calidad (hasta 40 millones de lecturas, o reads, por muestra), lo que permite disminuir el número de repeticiones, encontrar mutaciones puntuales en genomas eucariotas y tener mayor confianza en el ensayo; de forma que se eleva el valor del estudio. Además, los costos son accesibles (desde $ 300 por muestra), es mucho más rápido y de alta calidad. La capacidad del equipo para procesar un mayor número de muestras en menor tiempo lo hace ideal para realizar proyectos individuales, como los propuestos por nuestro grupo de trabajo, en los cuales se desea trabajar con no más de 20 muestras, pero de alta calidad. Este equipo ha sido diseñado para ser un instrumento de mesa rutinario, por lo que su instalación y preparación es rápida y sencilla. Su uso implica un flujo de trabajo sencillo que abarca desde la preparación de la librería hasta el análisis estadístico. También está integrado a un sistema que permite preparar los resultados para los subsecuentes análisis bioinformáticos, así como conectarse a una nube para salvaguardar la información.

Por otro lado, el NextSeqTM 550 tiene incorporado un sistema microarray que permite obtener resultados de pruebas específicas en tan solo unos minutos. Adicionalmente, el sistema de secuenciamiento y medición de calidad está basado en el software Real-Time Analysis (RTA v.2.0), cuya interpretación de datos masivos es mucho mejor a los anteriores y es el más moderno hasta la fecha. Este tipo de secuenciador no se encuentra disponible en nuestra institución ni en los alrededores. Una alternativa en la tercerización de este servicio; sin embargo, dos inconvenientes muy importantes son difícilmente superables: 1. el tiempo de envío de las muestras de ARN, que genera pérdida de calidad de la muestra, ya que el ARN es una molécula altamente inestable; y 2. el alto costo del servicio más el costo del envío en hielo seco (mayor a $ 1200). Las condiciones de envío son cruciales para garantizar la integridad de la muestra. Las diversas áreas de esta institución actualmente cuentan con proyectos que involucran estudios de secuenciamiento que podrían beneficiarse de la adquisición de este equipo. Potenciar estos estudios permitiría a nuestra institución estar a la vanguardia en el análisis de genomas, transcriptomas y exomas, áreas actualmente muy requeridas.

Lugar donde se instalará el equipo

El ambiente donde se colocará el equipo NextSeq550, estará ubicado en el ala derecha del cuarto piso del LID (Laboratorios de Investigación y Desarrollo), Sede Norte, Universidad Peruana Cayetano Heredia (UPCH). El LID está administrado por el Directorio del LID, cuyo el director es el doctor Abraham Jaime Vaisberg Wolach. La locación tendrá un área aproximada de 30.2 m3 (alto: 3.9 m., ancho: 3.15m., largo: 2.46 m.). El ambiente no cuenta con ventanas, lo que asegurará el menor ingreso de partículas contaminantes, tampoco tendrá ingreso directo de luz solar. La puerta de ingreso, cuyas dimensiones aproximadas son de 200 cm de alto y 110 cm de ancho, tienen las siguientes características: puerta de dos hojas, de material tipo madera, con una ventana central y con cerradura exterior

Proyección de uso

El equipo NextSeqTM 550 secuencia genomas completos, transcriptomas y exomas con alta calidad. Su rendimiento es de hasta 48 muestras en 20 horas, con más de 40 millones de lecturas por muestra.; incluyendo la adquisición de los datos, la duración de un experimento es 24h. Un estudio de 48 muestras requiere un experimento (1 día) o 3 experimentos (3 días), si se usan los cartuchos de 16 muestras (los primeros resultados garantizan la calidad de los siguientes). En una semana se procesarían cómodamente cuatro experimentos de 24 horas (96 horas de uso).

En la UPCH, 16 grupos usarían el equipo en las siguientes investigaciones: RNA (transcriptomas) de virus asociados con diarrea, parásitos (Trypanosoma, T. solium), plantas resistentes a sequía, líneas humanas asociadas a cáncer y diferentes patologías y ADN de microbiomas humanos y ambientales, bacterias asociadas a lixiviación y análisis de biodiversidad en peces transgénicos. Al respecto de la instituciones externas, se emplearía para lo siguiente: Transcripción bacteriana mediado por inhibidores sintéticos del ribosoma (UPC), Polimorfismo genético en niños asmáticos (USAT), Expresión de genes en biopelículas orales: Estudio metagenómico en microorganismos (SJB), Efecto de la microgravedad en la expresión genética de líneas celulares (UTEC) y Estudio metabolómico y la relación con el transcriptoma en M. tuberculosis (PUCP). Los 17 grupos de la UPCH tendrían el equipo disponible un 35% del año (17 semanas), otras instituciones 33% del año (16 semanas); quedarían 32% (15 semanas) para requerimientos extras.

Un secuenciador masivo no está disponible para nuestra institución. Se recurre a la tercerización, y los costos son superiores para secuenciar RNA, cuya estabilidad requiere especificaciones determinadas que garanticen la integridad de la muestra. Tener el equipo permitiría ahorrar considerablemente en costos y riesgos de envío, lo que haría posible obtener resultados a varios de los grupos mencionados. El costo por muestra es de $ 380, incluyendo todos los reactivos para RNAseq.

Estudio diferencial del trancriptoma de Mycobacterium Tuberculosis y Mycobacterium Bovis asociados a la pirazinamida: hacia la búsqueda de nuevos blancos terapéuticos

Tipo de proyecto: Investigación aplicada

Sectores: Salud

Tipo de sector: General

Área de conocimiento OCDE: Ciencias médicas y de salud

Sub área de conocimiento OCDE: Ciencias de la salud

Disciplina de conocimiento OCDE: Enfermedades infecciosas

Departamento: Lima

Provincia: Lima

Distrito: San Martin de Porres

Descripción

La pirazinamida (PZA) es la única droga antituberculosa que elimina efectivamente a Mycobacterium tuberculosis (MTB) de crecimiento lento, con lo cual se reducen las recaídas de tuberculosis de 20 % a 2 %; sin embargo, su mecanismo de acción es poco conocido. En el Perú, 50 % de los casos multidrogo resistentes son resistentes a PZA con alto riesgo de recaída. Por lo que la generación de nuevas drogas que eliminen a los bacilos persistentes es una prioridad.

La PZA tiene actividad luego de ser convertida a ácido pirazinoico (POA) mediante la acción de la pirazinamidasa (PZAsa) codificada por pncA. La teoría que POA, mediante ciclos de entrada y salida de la micobacteria, causa su muerte es aceptada; sin embargo, mutaciones en otros genes (Rpsa y PanD) pueden interferir en su acción. La resistencia está relacionada principalmente a mutaciones en pncA; no obstante, se ha reportado cepas con y sin mutaciones en pncA con actividad de PZAsa, lo que sugiere el efecto de otros genes en la resistencia a PZA.

Con la finalidad de conocer el mecanismo de acción de PZA, estudiaremos el efecto de PZA en el transcriptoma de MTB e identificaremos genes relacionados a resistencia a PZA. La función biológica de los genes seleccionados será estudiada mediante el silenciamiento génico en el sistema de represión transcripcional de CRISPRi. Asimismo, evaluaremos a nivel transcriptómica el efecto de PZA en M. bovis, resistente natural a PZA. La función de PZAsa de M. bovis será complementada con un plásmido conteniendo pncA silvestre.

Estos resultados nos permitirán conocer genes asociados a la resistencia a PZA. Los componentes de dichas rutas pueden ser blancos potenciales para nuevas drogas activas contra las micobacterias de crecimiento lento. Asimismo, nos permitirá identificar probables biomarcadores para la detección de la resistencia a PZA. Por otro lado, la caracterización enzimática de PZAsas mutantes recombinantes nos permitiría generar una herramienta predictora de resistencia a PZA en MTB.

Impacto social

El principal impacto social es sobre la salud pública y la pobreza. La tuberculosis es una enfermedad estigmatizante, que ataca principalmente a la población más pobre del Perú. El análisis transcriptómica nos permitiría estudiar la relación entre la expresión genética y la resistencia a PZA; posteriormente, nos permitiría estudiar a fondo la participación de los genes con expresión diferencial en rutas metabólicas en las que participa PZA y ácido pirazinoico (POA). Asimismo, los genes podrían ser candidatos de probables targets terapéuticos en el tratamiento contra TB, como base para futuros trabajos.

Impacto económico

En el Perú, en promedio se identifican 100,000 casos sintomáticos respiratorios al año, de los cuales aproximadamente 60,000 son confirmados con tuberculosis. De estos, 6,000 son casos de TB multidrogo resistente (TB-MDR). Lo cual involucra un costo de $ 5,000 para los tratamientos estandarizados y $ 15,000 para los tratamientos individualizados. Así, el costo anual solo en tratamientos es de alrededor de 30-90 millones de dólares. Un tratamiento oportuno, producto de un diagnóstico y determinación temprana de resistencia a PZA, reduciría la incidencia de casos de TB-MDR y resistencia adquirida a PZA. Por lo tanto, los costosos tratamientos con drogas de segunda línea no serían necesarios y en su lugar los pacientes podrían ser curados con tratamientos de primera línea, a razón de $500 por tratamiento completo. Esto es sin duda un ahorro económico importante para el Estado, lo cual confirma que, en salud pública, la prevención y el diagnóstico temprano son elementos importantes.

Impacto ambiental

Conocemos que el mecanismo de transmisión de la tuberculosis se produce a través de aerosoles contaminados con micobacterias dispersadas expelidas por un paciente bacílifero (con tuberculosis activa) y que, por tanto, al incrementarse el tiempo que el paciente tiene la enfermedad y no es tratado se eleva también el nivel promedio de contaminación ambiental con agentes bacteriológicos infecciosos. Por lo tanto, resulta clave reducir esta amenaza potencial para la población sana susceptible o en riesgo. De esta forma, los métodos de detección de resistencia a pirazinamida desarrollados en este proyecto permitirán que los pacientes con tuberculosis sean tratados apropiadamente y curados en menor tiempo.